玉研香煙染毒系統(tǒng) | 自動、靈活、安全建立香煙暴露小鼠模型——助力慢阻肺的病理研究

慢性阻塞性肺疾病（慢阻肺，COPD）是一種具有氣流阻塞特征的慢性支氣管炎和（或）肺氣腫，可進一步發(fā)展為肺心病和呼吸衰竭的常見慢性疾病。其致殘率和病死率居高不下，全球40歲以上人群中的發(fā)病率已高達9%～10%，嚴重危害著人們的健康。

慢阻肺以持續(xù)氣流受限為特征，這種氣流受限呈進行性發(fā)展，與氣道和肺臟對有毒顆粒或氣體的慢性炎性反應增強有關。氣流受限和氣道阻塞作為該疾病最重要的病理生理改變，其確切病因尚不完全明了，但普遍認為是由個體易患因素和環(huán)境因素共同作用的結果。許多患者還常常伴隨其他有臨床癥狀的慢性病，這無疑增加了慢阻肺的發(fā)病率和病死率。

在探討慢阻肺的病因時，我們不得不提的是吸煙這一最常見和最主要的危險因素。長期吸煙不僅直接損害呼吸道，還可能導致職業(yè)性粉塵和化學氣體等其他有害物質的吸入風險增加，從而加劇慢阻肺的發(fā)生。香煙中的有害物質通過誘導氣道上皮炎癥反應，破壞上皮屏障，促進免疫細胞的聚集，并導致粘液分泌過多和小氣道壁的重塑。

近期，復旦大學上海醫(yī)學院附屬中山醫(yī)院肺病危重癥醫(yī)學科張靜教授團隊在國際權威期刊上Free Radical Biology and Medicine發(fā)表一篇題為“ROS induced the Rab26 promoter hypermethylation to promote cigarette smoking-induced airway epithelial inflammation of COPD through activation of MAPK signaling”的文章。他們發(fā)現，香煙暴露會導致肺組織的表觀遺傳改變，這種改變與慢阻肺的慢性炎癥緊密相關。其中，DNA甲基化作為控制表觀遺傳轉錄的主要方式，在吸煙影響下的變化尤為關鍵。吸煙通過調節(jié)DNA甲基轉移酶的表達，進而影響到慢阻肺的發(fā)病過程。

此外，研究還揭示了香煙暴露下氣道炎癥反應的更深層次機制。香煙產生的活性氧（ROS）在這一過程中扮演著重要角色。ROS不僅調節(jié)DNMTs的表達，還影響到p53和Bcl2的功能，最終導致氣道上皮細胞的凋亡。盡管ROS在調控基因甲基化/去甲基化過程中的具體機制尚不完全清楚，但這一發(fā)現無疑為我們理解慢阻肺的發(fā)病機制提供了新的視角。

值得一提的是，Rab蛋白作為調節(jié)細胞功能的重要分子，在肺部炎癥中也發(fā)揮著不可忽視的作用。特別是Rab26，它被發(fā)現能夠抑制炎癥信號，減弱肺內皮細胞的炎癥反應。然而，在香煙暴露后，Rab26的作用機制及其與氣道炎癥的關系仍待進一步揭示。

這項研究不僅深化了我們對慢阻肺發(fā)病機制的理解，也為未來的治療提供了新的思路。通過深入研究ROS和Rab26等分子在氣道炎癥反應中的作用，我們有望開發(fā)出更為有效的預防和治療策略，為慢阻肺患者帶來福音。

文中提到，在卷煙暴露條件下，ROS通過促進DNMT3b介導的Rab26啟動子DNA甲基化來抑制Rab26的表達，下調Rab26的表達可增強p38和JNK MAPK信號的激活，導致炎癥細胞因子的過量產生；NAC（N-乙酰半胱胺酸）恢復Rab26也可減輕香煙暴露誘導的氣道上皮炎癥反應

研究者首先建立了香煙暴露小鼠模型，使用全身香煙煙霧暴露系統(tǒng)，將小鼠（n = 5）暴露于20支香煙中，每天兩次，每周6天，持續(xù)2小時，持續(xù)三個月。對照組（n = 5）保持在相同的環(huán)境中，包括相同的食物量，不接觸香煙。全身香煙煙霧暴露系統(tǒng)由上海玉研儀器提供，配備全自動香煙煙霧發(fā)生器、暴露箱體和層流生物安全柜。為避免操研究者接觸二手煙，暴露箱體設置在層流生物安全柜內，香煙由自動香煙煙霧發(fā)生器產生，并被泵入暴露箱。隨后采集小鼠肺和支氣管肺泡灌洗液（BALF）進行H&E染色、免疫組化（IHC）和炎癥介質測定。同時測定小鼠的體重、白細胞計數、Hct和HbCO水平。

香煙暴露誘導氣道上皮炎癥反應

香煙暴露染毒的氣道炎癥反應是COPD的一個主要特征。在此，研究者評估了體內和體外香煙暴露氣道上皮的炎癥反應。H&E染色顯示，香煙暴露小鼠氣道上皮結構被破壞，支氣管周圍出現大量中性粒細胞（圖.1A）。此外，肺泡空間擴大和破壞（圖.1A）。病理改變與吸煙相關的COPD和肺氣腫一致。全身香煙暴露小鼠的全身性炎癥水平也被評估。與對照組相比，全身暴露小鼠的BALF IL-8和IL-6水平顯著升高（圖.1B＆C）。

圖1.香煙暴露誘導體內和體外炎癥反應

香煙暴露抑制了Rab26在氣道上皮中的表達

數據顯示，在COPD患者的樣本中，肺組織中Rab26水平的PKM明顯低于非COPD患者（圖.2A）.IHC數據顯示，香煙暴露的小鼠的肺氣道上皮細胞中Rab26的表達低于對照組小鼠（圖.2B）.此外，與對照組相比，香煙暴露的小鼠肺組織中Rab26的表達降低（圖.2C）。

圖2.香煙暴露抑制了Rab26在體內和體外的表達

DNMT3b調控Rab26的表達

DNA甲基轉移酶（DNA Methyltransferase， DNMT）家族成員在介導基因DNA甲基化中起關鍵作用。因此，研究者探索了DNTM3B在香煙暴露誘導的Rab26啟動子DNA甲基化中的作用。研究者發(fā)現DNMT3B在香煙暴露小鼠肺組織中的表達增加（圖.3A）。免疫組化分析還顯示，與對照組相比，香煙暴露組氣道上皮DNMT3B水平升高（圖.3B）。

圖3.Rab26抑制香煙暴露誘導的起到上皮細胞炎癥反應

ROS通過調控DNMT3b抑制Rab26的表達

為了確認ROS對Rab26表達的影響及其通過啟動子甲基化的潛在機制，研究者將細胞用不同劑量的H₂O₂（一種ROS）處理2小時。數據顯示H₂O₂增加DNMT3B蛋白的產生，抑制Rab26的表達（圖.4E）。與上述結果一樣，NAC預孵育細胞后，H₂O₂存在下Rab26的下調表達得到部分恢復（圖.4F）。熒光素酶檢測顯示H₂O₂抑制Rab26啟動子的活性（圖.4G）。這些數據表明，香煙暴露誘導的ROS抑制了Rab26啟動子的活性，下調了Rab26的表達，導致炎癥介質的產生。而NAC能部分逆轉香煙暴露對Rab26表達的抑制作用。

圖4.ROS通過調控DNMT3b抑制Rab26的表達

抗氧化劑增強Rab26表達，減輕COPD小鼠的炎癥反應

體外實驗顯示，香煙暴露誘導的氧化劑導致上皮細胞中Rab26的生成減少，炎癥增加，而NAC（N-乙酰半胱胺酸）是目前廣泛應用于治療COPD患者。本研究通過NAC證實抗氧化劑對體內Rab26表達的調節(jié)作用，以及提高肺組織中Rab26表達對COPD小鼠炎癥反應的影響。H&E顯示NAC改善了鰓周區(qū)域的炎癥細胞浸潤（圖.5A）。圖7B顯示，小鼠在香煙暴露期飲用NAC溶液后，Rab26表達升高，DNMT3b水平下降。同樣，與香煙暴露組相比，NAC/香煙暴露組肺氣道上皮中Rab26表達升高，DNMT3b表達降低（圖.5C）。此外，NAC處理抑制香煙暴露誘導的IL-8和IL-6的BALF水平（圖.5D＆E）。這些數據表明，ROS可能通過促進DNMT3b介導的DNA甲基化和改善香煙暴露誘導的COPD小鼠炎癥反應中Rab26的表達來抑制Rab26。

圖5.抗氧化劑增強了Rab26表達，減輕COPD小鼠的炎癥反應

在構建慢性阻塞性肺疾?。?/span>COPD）的動物模型時，玉研儀器精心選擇了一些關鍵的造模參數，以確保模型的準確性和可靠性。

首先，考慮到香煙暴露作為COPD發(fā)病的主要因素，因此需設定精確的香煙暴露條件。通過控制香煙煙霧的濃度、暴露頻率和持續(xù)時間，可以成功模擬出長期吸煙對肺組織的損害作用。

其次，為了模擬COPD患者肺部炎癥的復雜環(huán)境，引入了多種炎癥介質和細胞因子的刺激。這些介質和因子的種類、濃度和作用時間均經過精心調整，以最大程度地模擬COPD患者體內的炎癥反應。

此外，還需注重模擬COPD患者肺部氣流受限的特征。通過調整氣道阻力、肺順應性和通氣功能等參數，可以成功構建具有氣流阻塞特征的COPD模型。

在整個造模過程中，嚴格遵循科學原則，確保實驗數據的準確性和可重復性。同時，研究者還需注重動物福利和倫理原則，確保實驗過程對動物的傷害最小化。

通過這些精心設計的造模參數，可以成功構建能夠真實反映COPD病理生理改變的動物模型，為后續(xù)的研究提供了有力的工具：

1、僅用香煙暴露進行小鼠造模：待小鼠適應實驗環(huán)境后，被隨機分配到四個組：對照組、PM2.5組、吸煙組和PM2.5+吸煙組，每組有7只小鼠。對照組小鼠僅暴露在室內空氣，無PM2.5。PM2.5組小鼠通過超聲波霧化器吸入PM2.5（濃度為110 μg/m³）。吸煙組小鼠在香煙暴露染毒箱內吸入香煙煙霧（在2.5小時內消耗10支香煙）。PM2.5+吸煙組小鼠同時暴露于PM2.5和香煙煙霧中。暴露方式：所有小鼠每周5天，每天兩次接受上述處理，持續(xù)10個月。實驗結束后，小鼠被處死，并收集肺組織進行分析。

2、香煙暴露聯合氣道內滴注脂多糖方法進行造模：持續(xù)時間8周，除空白組外，其余各組小鼠置于自動小動物熏煙箱中，將香煙插入自動點煙盒，點燃后打開微型真空泵，將煙霧引入暴露箱體中。每天進行香煙暴露兩次，間隔3小時，每次點煙8支，煙霧最大濃度狀態(tài)維持30min。（備注：每次30min熏煙過程中可間隔15min適當通入少量氧氣，警惕小鼠缺氧死亡）熏6天停1天，連續(xù)熏煙8周。在第1、14、21天用10%水合氯醛0.3ml/100g對各組小鼠進行腹腔麻醉，后切開頸部皮膚，暴露氣管，空白組予0.2ml生理鹽水氣道內注射，其余各組予濃度為1mg/ml的脂多糖0.2ml氣管注射（注射當日不熏煙）。

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